Прозоркина H. В., Рубашкина П. А. - Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии

6. Санитарно-вирусологическое исследование почвы.

Основные методы определения микробиологических показателей, характеризующих фекальное загрязнение почв

Определение кишечных палочек в почве титра1щонным методом

Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида ТТХ). Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 гит. д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред.

Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон— по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ с трифенилформазаном, выпадающим в виде осадка и придающим среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится.

Посевы на среде Кесслера выращивают 48 часов при 43 °С или 37°С. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился.

При наличии в сосудах со средой Кесслера газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный ответ.

При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2—3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4—5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают коли-титром.

Определение в почве общего количества бактерий

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, присущих на мясопептонном агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15—20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

После инкубации подсчитывают выросшие колонии.

Определение в почве общего количества бактерий

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, растущих на мясопептонном агаре при 37 °С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5 % мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений. После тщательного перемешивания берут по 1 мл суспензии и переносят на дно двух стерильных чашек Петри. В каждую чашку вливают питательный агар в количестве 15—20 мл расплавленного и остуженного до 45°С. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После инкубации при температуре 37 °С 24 часа подсчитывают выросшие колонии.

Определение клостридиум перфрингенс в почве

Из всех приготовленных почвенных разведений (до 1 : 1000 000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С — 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9—10 мл среды Вильсон—Блер. Инкубация посевов производится при 37° С в течение 24 часов.

Cl. perfringens образуют колонии черного цвета, в мазках — грамположительные палочки.

Определение в почве нитрифицирующих бактерий

Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в почве азотсодержащих соединений, окисляя аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому численность этих микроорганизмов довольно четко указывает на степень органического загрязнения, скорости и окончания распада органики в почве.

Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего для этих целей применяется среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащей контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14—15 суток.

При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно образуются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять на 5—7-й день после посева и вторично на 14—15-й день. Титр нитрифицирующих бактерий чаще всего устанавливают с помощью качественной пробы с дифенилаланином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменения окраски.

ВОПРОСЫ для самоконтроля

1. Какова нормальная микрофлора почвы ?

2. Какие факторы влияют на качественный и количественный состав почвы ?

3. Что вы знаете о процессах самоочищения в почве?

4. В каких случаях проводят санитарно-бактериологичес-кое исследование почвы ?

5. Назовите основные правила отбора проб почвы для бактериологического анализа.

6. Какие исследования проводят при полном санитарно-мик-робиологическом анализе почвы ?

7. Какие сведения содержит паспорт обследуемого участка земли и сопроводительный талон?

8. Назовите критерии оценки санитарного состояния почвы.

9. Какие показатели характеризуют фекальное загрязнение почвы ?

10. Какова цель определения в почве нитрифицирующих бактерий?

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Приготовить образец почвы для санитарно-бактериоло-гкческого исследования.

2. Произвести разведение почвы 1:10 и ряд последовательных разведений 1:100; 1:1000; 1:10000.

3. Определить бактерии группы кишечной палочки в почве титрационным методом.

4. Определение микробного числа почвы: пользуясь демонpaHHOHHbiMH посевами на МПА различных разведений почвенной суспензии, подсчитать микробное число и про-микроскопировать материал из отдельных колоний.

5. Изучение посевов почвы на срезах Кесслера и Эндо: обратить внимание на характерный рост кишечной палочки.

6. Изучение характера роста на Cl. perfringens на среде Вильсон—Б лер.

§ 6. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов

Общая характеристика микрофлоры пищевых продуктов

Микрофлора пищевых продуктов подразделяется на специфическую и неспецифическую. К специфической относятся микроорганизмы, используемые для приготовления некоторых продуктов, формирующие продукт или специально добавляемые в него для придания определенных вкусовых и питательных качеств. Без специфической микрофлоры фактически не может существовать и сам продукт. Невозможно представить себе приготовление простокваши и кефира без молочнокислых бактерий, пива — без участия дрожжей и т.д.

Специфическая микрофлора представляет интерес для бактериологов, работающих на предприятиях пищевой промышленности. Они постоянно следят за чистотой штаммов, за сохранением их биологических свойств, от которых зависит качество выпускаемого продукта.

В производстве кисломолочных продуктов (простокваши, масла, творога и т. п.) чаще всего используется молочнокислый стрептококк и в дополнение к нему сливочный стрептококк. Молочнокислый стрептококк — это грамполо-жительные кокки, располагающиеся попарно, он сбраживает лактозу, глюкозу, галактозу с образованием кислоты и газа. Клетки сливочного стрептококка располагаются в виде цепочек, они придают продукту сметанообразную консистенцию. Иногда в кисломолочные продукты добавляют арома-тобразующие стрептококки: стрептококкус цитроворус, стреп-тококкус диацетилактис и др. Большинство молочнокислых стрептококков может расти на мясопептонном агаре, образуя при поверхностном посеве очень мелкие круглые выпуклые колонии, а при глубинном посеве — колонии в виде чечевичных зерен.

Помимо стрептококков, в приготовлении кисломолочных продуктов принимают участие и молочнокислые палочки. Некоторые кисломолочные продукты (простокваша, ацидофильное молоко и др.) готовят на чистой культуре молочнокислых палочек — это довольно крупные бесспоровые грам+ палочки. Они, как правило, не растут на МПА.

Кефир получают с помощью так называемого кефирного грибка. Основа грибка состоит из плотного войлокообраз-ного сплетения нитей (палочка стромы), среди которых находятся скопления микроорганизмов, формирующих кефир: молочнокислых стрептококков, молочнокислых палочек и дрожжеподобных грибков.

В препарате, приготовленном из суточного кефира, можно обнаружить главным образом молочнокислые стрептококки, в небольшом количестве молочнокислые палочки и не в каждом поле зрения дрожжевые клетки. В двухсуточном кефире появляется большое количество дрожжевых клеток.

Микроорганизмы молочнокислого брожения участвуют также и в таких процессах, как квашение, мочение овощей и фруктов.

Неспецифическая микрофлора попадает на продукт случайно, загрязняя его. В большинстве своем это микробы-сапрофиты, различные представители палочковидной и кокковой флоры.

При определенных условиях часть микрофлоры может вызвать изменения органолептических свойств пищевого продукта, его порчу. Так, при длительном хранении молока на холоде могут развиваться жирорасщепляющие микробы, вызывающие прогоркание молока; «тягучая болезнь» хлеба обусловлена развитием микробов группы мезентерикус и т. п.

При несоблюдении санитарного режима на пищевых предприятиях продукт в значительной степени «обрастает» посторонней неспецифической микрофлорой, среди которой могут встретиться и патогенные для человека микробы — возбудители инфекционных заболеваний или пищевых от-

12. Зак 361 равлений. Многие патогенные микробы не только выживают в пищевом продукте в течение некоторого времени, но и способны размножиться в нем. Всем известны «молочные эпицелии» брюшного тифа или кишечные формы сибирской язвы, возникающие при употреблении зараженных продуктов, и т. п.

Общие принципы санитарно-микробиологического исследования пищевых продуктов

Конечной целью санитарно-бактериологического контроля пищевых продуктов является профилактика пищевых отравлений.

При плановом санитарно-бактериологическом контроле пищевых продуктов подлежат исследованию:

количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАны) (общее количество микробов) (ГОСТ 10444. 15—94) (приложение № 1);

* количество бактерий группы кишечных палочек (БГКП), а в части продуктов — количество БГКП методом наиболее вероятного числа (НВЧ) (ГОСТ Р 50474—93);

* коагулазоположительные стафилококки (St. aureus) (ГОСТ 30347-97); бактерии рода Proteus;

* бактерии рода Salmonella в 25 г продукта (ГОСТ Р 50480—93).

Пищевые продукты исследуют:

а) с целью выделения различных патогенных микроорганизмов по эпидемиологическим показаниям в случаях инфекционных заболеваний и пищевых отравлений; б) с целью планового контроля за качеством сырья и продукта в процессе его приготовления; в) с целью контроля за готовой продукцией, поступающей потребителю; г) с целью определения соответствия качества продукта требованиям стандарта.

Определение общей обсемененности продуктов или микробное число, т. е. количество колоний, выросших при посеве 1 г или 1 мл продукта, имеет смысл только при исследовании пищевых продуктов, не содержащих специфическую микрофлору, так как на МПА, особенно после 48-часовой инкубации, могут вырастать, например, молочнокислые стрептококки и другие представители специфической микрофлоры. Определение общей обсемененности можно производить на этапах получения продукта, начиная с исходного сырья. Как известно, методы стерилизации и пастеризации часто не приводят к полному обеспложиванию продукта. Остаточная микрофлора представлена главным образом термофильными споровыми микробами. Естественно, что остаточной микрофлоры будет тем меньше, чем меньше загрязнено исходное сырье.

Нарастает микробное число при нарушении технологии приготовления продукта, главным образом при нарушении санитарно-гигиенических правил на предприятиях.

Нередко продукт обсеменяется различными микроорганизмами вторично в процессе транспортировки и хранения. В качестве примера могут служить студни. Технология их приготовления такова (двойная проверка), что почти исключает сохранение микроорганизмов, однако студни, поступающие в лабораторию для исследования, в значительном проценте случаев весьма обсеменены разнообразной микрофлорой. Виной тому чаще всего является неправильное хранение продукта (при температуре 6°С), удлинение сроков реализации (более 12 часов) и другие нарушения общепринятых гигиенических правил.

Важное значение имеет определение загрязненности продукта микробами группы кишечной палочки.

Следует иметь в виду, что некоторые продукты (например, молоко и молочные продукты) в силу своего происхождения неизбежно бывают загрязнены кишечными палочками, поэтому при суждении о качестве имеет значение не только факт наличия кишечной палочки, но и степень обсе-мененности ею пищевого продукта, т. е. коли-титр. Коли-титр, как правило, определяется бродильным методом. В качестве среды накопления чаще всего используется среда Кесслера.

Наличие в среде генцианвиолета дает возможность ни-гибировать постороннюю, главным образом Гр+ микрофлору, которая всегда в том или ином количестве находится в пищевых продуктах. Желчь создает благоприятные условия для развития микробов группы кишечной палочки.

Помимо группы кишечной палочки, для некоторых продуктов известное санитарно-показательное значение имеют и другие микроорганизмы. Так, для кремовых изделий, которые нередко являются источниками стафилококковых интоксикаций, определенное значение имеет исследование с целью выделения коагулазоположительных стафилококков. Мясные продукты, например, студни, колбасы, исследуются также на наличие микробов группы протея, способных вызвать порчу продуктов, а иногда и пищевое отравление.

На некоторые продукты имеются общесоюзные стандарты (ГОСТы) в отношении методики их исследования, а также нормирования качества продукта по бактериальным показателям. Унификация санитарно-бактериологических методик необходима для того, чтобы получать однородные результаты.

Пищевые отравления

Пищевые отравления бактериальной этиологии подразделяются на пищевые токсикоинфекции и пищевые токсикозы, а также отравления смешанной этиологии.

К пищевым токсикоинфекциям относятся острые кишечные заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых произошло массивное размножение микроба-возбудителя и накопление токсинов.

К возбудителям пищевых токсикоинфекции относятся представители семейства энтеробактерий — протеи, цитро-бактер, гафния, клебсиелла; семейства стрептококков, семейства бациллярных и семейства псевдомонад.

К пищевым токсикозам относятся бактериальные токсикозы: ботулизм, стафилококковая пищевая интоксикация и микотоксикозы.

Методы лабораторной диагностики пищевых отравлений:

1) бактериологический — выделение чистой культуры и ее идентификация до серовара и фаговара;

2) серологический — обнаружение антител в сыворотке заболевших;

3) биологический — заражение лабораторных животных, в основном при расшифровке токсикозов (стафилококкового, ботулизма).

Исследование проб пищевых продуктов, предположительно послуживших причиной отравления, целесообразно проводить на соответствие ГОСТов, таких как ГОСТ Р 50474—93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (приложение № 2); ГОСТ Р 50480—93 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella (приложение № 4) и др.

§ 7. Отбор, направление и подготовка проб для лабораторного исследования

Отбор проб для бактериологического исследования следует производить в стерильные широкогорлые банки, зак- рываемые пергаментной бумагой и обвязанные бечевкой. Остатки консервов направляются на исследование непосредственно в той банке, из которой они использовались в пищу.

Мясо берут для анализа в количестве 500 г, при этом пробу отбирают из различных мест туши с обязательным взятием мезентериальных лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости.

Мелкую рыбу отбирают в количестве 2—3 штук, от крупной рыбы — 2—3 куска, в том числе из спинки, ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия.

Соленые продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. В отдельную посуду набирают 100—200 мл рассола.

Пробы жидких, полужидких объектов (супы, соусы, кремы, молочные продукты) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 г.

Пробы испражнений отбирают из последней более жидкой порции, поступающей из верхних отделов кишечника. При наличии в испражнениях гноя, слизи, крови, их необходимо включить в отбираемый материал.

Рвотные массы отбирают в количестве 50—100 мл, промывные воды — 100—200 мл, до применения каких-либо лекарственных средств.

Кровь у заболевших забирают в стерильную сухую пробирку в количестве 8—10 мл.

Пробу мочи на исследование берут в количестве 20— 30мл.

Желчь и содержимое 12-перстной кишки берут на исследование при помощи дуоденального зонда.

Спинномозговую жидкость отбирают в стерильную пробирку в количестве 5—10 мл.

Отбор проб воды производят в количестве не менее 1,5 литров.

Пробы секционного материала забирают в количестве 50— 60 г каждого органа или ткани.

В лабораторию пробы доставляют в опечатанном виде.

В сопроводительном документе к материалам от заболевших (умершего)указывается: Ф.И.О., возраст, адрес, место работы, должность, дата заболевания, дата и время сбора материала, фамилия и должность лица, направившего материал.

Исследование материалов, доставленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления, производится немедленно по их получении.

Исследование материалов от пострадавших:

кровь засевают в питательную среду (Раппопорт или желчный бульон) в соотношении 1 : 10 (5 мл на 45 мл среды). Термостатируют 10 дней при 37°С, делая высев на среду Эндо через 18—24 часа, на 3, 4, 6, 10-е сутки. При наличии роста работают по общепринятой методике.

Желчь засевают в количестве 5 мл на 45—50 мл мясо-пептонного бульона (1 : 10), помещают на 7 суток в термостат при 37°С и делают высевы через 18—20 часов и 3, 5, 7 суток на среду Эндо. При наличии подозрительного роста работают по общепринятой методике.