Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

Вопрос о способности бесцветных серобактерий существовать автотрофно также пока не доказан: чистые культуры могут расти только в присутствии органических соединений; не обнаружено типичных для эубактерий механизмов автотрофной ассимиляции CO2. Все это заставляет склоняться в пользу того, что бесцветные серобактерии могут существовать только хемогетеротрофно. В микроаэробных условиях некоторые штаммы Beggiatoa обнаруживают способность к азотфиксации.

Распространение и роль в природе. Окисление неорганических восстановленных соединений серы с помощью фототрофных и хемотрофных эубактерий является одним из звеньев круговорота серы в природе. В первом случае процесс протекает в анаэробных условиях, во втором — в аэробных. Хемотрофы, окисляющие серу, обитают в морских и пресных водах, содержащих O2, в аэробных слоях почв разного типа. Поскольку эта группа объединяет организмы с разными физиологическими свойствами, ее представителей можно обнаружить в кислых горячих серных источниках, кислых шахтных водах, в водоемах со щелочной средой и высокой концентрацией NaCl.

Хемолитоавтотрофные серобактерии обнаружены на глубине 2600–6000 м в местах, где на поверхность дна океана из недр земной коры выходят горячие источники. Вода источников, называемая гидротермальной жидкостью, имеет температуру до 350°, не содержит совсем O2 и NO3 – но обогащена H2S, CO2 и NH4+. H2 дне океана гидротермальная жидкость смешивается с окружающей морской водой, имеющей температуру 2°, которая, наоборот, не содержит H2S и характеризуется достаточно высокими уровнями O2 и NO3 – . Эти области отличаются также высоким давлением н полным отсутствием света.

К удивлению исследователей, вокруг выходов гидротермальной жидкости были обнаружены плотные скопления необычных беспозвоночных животных, среди которых преобладали гигантские живущие в трубках черви Riftia pachyptila длиной до 2,5 м и толщиной до 5 см, крупные белые двустворчатые моллюски Calyptogena magnified и мидии Bathymodiolus thermophilus. Имелись там креветки, крабы и рыбы в немалых количествах. Как объяснить наличие таких "оазисов" жизни в "пустыне", которой до недавнего времени считали дно океана на большой глубине?

Из проб воды, взятых у гидротермальных выходов, выделены бактерии, среди которых некоторые виды были H2S-окисляющими хемолитоавтотрофами, идентифицированными как представители родов Thiomicrospira и Thiobacillus. Такие бактерии могут составить первое звено трофической цепи в экосистеме гидротермальных источников, обеспечивая пищей различные виды животных.

Однако вскоре обнаружилось, что одно из преобладающих животных R. pachyptila не может питаться частичками пищи, поскольку представляет собой просто замкнутый мешок без ротового, анального отверстий и пищеварительной системы. H2 переднем конце тела животного располагаются ярко окрашенные щупальца. В мешке заключены внутренние органы, самый крупный из них, занимающий почти всю полость тела, — трофосома, в которой обнаружено множество бактерий, окисляющих H2S, запасающих энергию в молекулах АТФ и использующих ее затем для фиксации CO2 в восстановительном пентозофосфатном цикле. Бактерии локализованы внутри клеток трофосомы. R. pachyptila получает от бактерий органические соединения, а в обмен поставляет им необходимые для осуществления хемоли-тоавтотрофного метаболизма вещества (CO2, O2, H2S), поглощая их из внешней среды щупальцами (темно-красный цвет щупалец обусловлен присутствием большого количества крови, богатой гемоглобином), откуда они по кровеносной системе переносятся в трофосому к бактериям. Таким образом, отношения между R. pachyptila и серобактериями — типичный пример внутриклеточного симбиоза мутуалистической природы.

Исследования других животных, обитающих у гидротермальных источников, показали, что R. pachyptila — не единственный вид, симбиотически связанный с хемолитоавтотрофными бактериями. Моллюски C. magnifica и В. thermophilus также содержат хемосинтетических эндосимбионтов, но бактерии у них обитают в жабрах, где могут легко получать O2 и CO2 из проходящего сквозь жабры потока воды, a H2S моллюск поглощает своей вытянутой в длину ногой, которая погружена в источник, где концентрация сульфида наиболее высокая. Из ноги H2S переносится с кровью в жабры к бактериям.

Симбиозы, подобные описанному выше, обнаружены в других местах, богатых H2S, в том числе в мангровых и травяных соленых болотах, у мест просачивания нефти, в районах сброса сточных вод. Число видов беспозвоночных, в которых найдены такие эндосимбионты, достаточно велико, и список этот постоянно растет.

Важное следствие открытия симбиозов, компонентом которых являются хемолитоавтотрофные бактерии, — существование экосистем, в которых первичными продуцентами служат не фотоавтотрофные, а хемолитоавтотрофные организмы.

Окисление восстановленных соединений серы до сульфатов, осуществляемое этими бактериями, приводит к подкислению окружающей среды, что может иметь положительные и отрицательные последствия. Подкисление почвы приводит к переводу некоторых соединений, например фосфатов, в растворимую форму, что делает их доступными для растений. Окисление нерастворимых сульфидных минералов, сопровождающееся переводом металлов в растворимую форму, облегчает их добычу. Однако накопление серной кислоты в результате деятельности этих бактерий может приводить к порче и разрушению различных сооружений.

Железобактерии

Способность осаждать окислы железа и марганца на поверхности клеток присуща многим эубактериям, различающимся морфологическими и физиологическими признаками и принадлежащим к разным таксономическим группам. В вопросе о том, какие организмы следует относить к железобактериям, нет единого мнения. С. Н. Виноградский впервые термин "железобактерии" применил для обозначения организмов, использующих энергию окисления Fe2+ до Fe3+ для ассимиляции CO2, т. е. способных существовать хемолитоавтотрофно. X. Молиш к железобактериям относил все организмы, откладывающие вокруг клеток окислы железа или марганца независимо от того, связан ли этот процесс с получением клеткой энергии.

Накопление окислов железа и марганца на поверхности бактериальных клеток — результат двух взаимосвязанных процессов: аккумуляции (поглощения) клетками этих металлов из раствора и окисления, сопровождающегося обильным отложением нерастворимых окислов на поверхности бактерий. Процесс аккумуляции тяжелых металлов из растворов в основе имеет физико-химическую природу и в значительной мере обусловлен химическим составом и свойствами поверхностных структур клетки. Он включает связывание металлов внеклеточными структурами (капсулы, чехлы, слизистые выделения), клеточной стенкой и ЦПМ. Сорбционные свойства поверхностных клеточных структур определяются в большой степени суммарным отрицательным зарядом молекул, входящих в их состав. Поглощение металлов приводит к значительному концентрированию их вокруг клеток по отношению к среде. Коэффициент накопления для железа и марганца может достигать величины 105–106.

Как известно, Fe2+ подвергается быстрому химическому окислению молекулярным кислородом при pH>5,5, что приводит к образованию нерастворимого Fe(OH)3. Последний вместе с Fe2+ неспецифически связывается клеточными кислыми экзополимерами. Подобный тип накопления железа не зависит от метаболической активности клеток.

Mn2+ более устойчив к окислению O2, чем Fe2+. Его химическое окисление (Mn2+ ® Mn4+) молекулярным кислородом с заметной скоростью происходит только при pH>8,5. Поэтому в нейтральной среде окисление марганца имеет только ферментативную природу. Окисление Fe2+ и Mn2+ с последующим отложением нерастворимых окислов вокруг бактериальных клеток может быть результатом взаимодействия ионов металлов с продуктами бактериального метаболизма, в частности с H2O2, образующейся в процессе окисления органических веществ при переносе электронов по дыхательной цепи. Перекись водорода, возникающая в качестве промежуточного или конечного продукта окисления, выделяется из клеток и накапливается в окружающих их структурах. В нейтральной или слабокислой среде окисление Fe2+ до Fe3+ происходит в результате непосредственного взаимодействия с H2O2:

2Fe2+ + H2O2 + 2Н+ ® 2Fe3+ + 2H2O.

Окисление марганца при взаимодействии с H2O2 осуществляется при участии каталазы, выполняющей пероксидазную функцию. Mn2+ в этом случае служит донором электронов:

Mn2+ + 2H2O2 ® MnO2 + 2H2O.

Описанные выше процессы протекают в капсулах, чехлах, слизистых выделениях, на поверхности клеточной стенки, в которых концентрируются все компоненты реакции: восстановленные формы железа и марганца, перекись водорода, каталаза. Физиологический смысл процессов окисления Fe2+ и Mn2+ с участием H2O2 — детоксикация вредного продукта метаболизма. Ни в одном случае окисление железа и марганца не приводит к получению бактериями энергии.

Наконец, среди железобактерий есть организмы, у которых окисление Fe2+ связано с получением энергии. В этом случае отложение окислов железа служит показателем активности энергетических процессов. Возможность получения энергии бактериями при окислении Mn2+ экспериментально не доказана.

В изучении железобактерий в последнее время достигнуты большие успехи, связанные с получением чистых культур ряда этих организмов. Стало понятным, что это разнообразная группа бактерий, способных окислять и откладывать окислы железа и/или марганца вне или иногда внутри клетки66. H2 основании морфологических характеристик все железобактерии могут быть разделены на две группы: нитчатые и одноклеточные.

66 К железобактериям, откладывающим железо внутри клетки, относятся магнитотактические бактерии.

К первой группе относятся грамотрицательные нитчатые бактерии, окруженные чехлом. Наиболее широко распространены представители родов Leptothrix и Sphaerotilus (см. рис. 44, 1, 2). Нити неподвижные или передвигающиеся скольжением. В чехлах, окружающих нити, накапливаются окислы железа и марганца (Leptothrix) или только железа (Sphaerotilus и др.).

Железобактерии этой группы — облигатные аэробы, но могут удовлетворительно расти при низком содержании O2 в среде. Оптимальный pH для роста — 6–8. Единственно возможный способ существования — хемоорганогетеротрофия, при этом представители рода Sphaerotilus предпочитают условия с относительно высоким содержанием органических веществ, а многие штаммы Leptothrix — среды с низким уровнем органики.

Окисление железа и марганца и отложение их окислов в чехлах этих бактерий не связано с получением ими энергии. К окислению Fe2+ при pH 6–8 могут приводить процессы как химической, так и биологической природы. Окисление марганца в этих условиях имеет биологическую природу. В обоих случаях окисление связано с действием перекиси водорода, количество которой в среде в определенных условиях может достигать 10–20 мг/л. Процесс локализован в чехлах, где концентрируются продукты метаболизма и внеклеточные ферменты. У мутантов, лишенных чехлов, накопления окислов железа и марганца не происходило. Таким образом, с помощью восстановленных форм железа и марганца обеспечивается удаление H2O2 — токсического продукта клеточного метаболизма.

Помимо бесцветных к нитчатым железобактериям относятся и некоторые фотосинтезирующие эубактерии из группы цианобактерий и скользящих зеленых бактерий.

Вторая группа железобактерий включает одноклеточные организмы из разных таксонов. Она представлена эубактериями с грамположительным и грамотрицательным строением клеточной стенки или без нее, размножающимися поперечным делением или почкованием. Клетки разной формы и размеров (форма может меняться в зависимости от стадии и условий роста), одиночные или формирующие скопления, окруженные капсулами, в которых откладываются окислы железа и марганца. Принадлежащие к этой группе железобактерии распадаются на две подгруппы, различающиеся типом метаболизма и отношением к кислотности среды.

Первая подгруппа объединяет железобактерии, растущие в. нейтральной или слабощелочной среде и характеризующиеся хемоорганогетеротрофным типом метаболизма. Представители подгруппы — свободноживущие микоплазмы, объединенные в роды Metallogenium, Gallionella, Siderococcus. Им свойствен типичный для микоплазм полиморфизм: кокковидные клетки, от которых могут отходить тонкие нити, пучки переплетенных тонких нитей и т. д. H2 поверхности нитей откладываются окислы железа (Gallionella, Siderococcus) или железа и марганца (Metallogenium). Растут в нейтральной или кислой среде. Некоторые из них олиготрофы. Все — аэробы или микроаэрофилы. Отложение окислов железа и марганца — результат химических реакций или функционирования перекисного пути и не имеет отношения к получению клетками энергии.

Вторую подгруппу составляют в большинстве аэробные ацидофильные формы. Оптимальный pH их роста лежит ниже 4,5 (2–3). В этих условиях Fe2+ в присутствии O2 устойчиво к химическому окислению. Для ацидофильных железобактерий установлена способность получать энергию в результате окисления двухвалентного железа.

Основным представителем железобактерий с энергетическим метаболизмом хемолитотрофного типа является Thiobacillus ferrooxidans, относящийся к группе тионовых бактерий и обладающий способностью получать энергию также в результате окисления различных восстановленных соединений серы. Окислять закисное железо с получением клеткой энергии способна и выделенная недавно облигатно ацидофильная бактерия Leptospirillum ferrooxidans, близкая по ряду свойств к Т. ferrooxidans, но в отличие от последнего не окисляющая соединения серы.

Leptospirillum ferrooxidans и большинство изученных штаммов Т. ferrooxidans принадлежат к облигатным хемолитоавтотрофам, использующим энергию окисления железа для ассимиляции CO2, служащей основным или единственным источником углерода. Некоторые штаммы Т. ferrooxidans оказались способными расти на средах с органическими соединениями, являясь, таким образом, факультативными хемолитоавтотрофами. Наконец, описаны термофильные бактерии, получающие энергию в результате окисления Fe2+ и нуждающиеся для роста в органических соединениях, т. е. осуществляющие метаболизм хемолитогетеротрофного типа.

Окисление железа, приводящее к получению энергии, происходит в соответствии с уравнением 2Fe2+ + 1/2O2 + 2Н+ ® 2Fe3+ + H2O, что сопровождается незначительным изменением уровня свободной энергии (DG0' при pH 2 равно — 33 кДж/моль). Поэтому для обеспечения энергией клетке необходимо "переработать" большие количества железа.

Механизм окисления Fe2+ в дыхательной цепи изучен у Т. ferrooxidans. Дыхательная цепь этой бактерии содержит все типы переносчиков, характерные для дыхательной системы аэробных хемоорганотрофных эубактерий, но участок цепи, связанный с получением энергии, очень короток (рис. 98, А).

Окисление Fe2+ происходит на внешней стороне ЦПМ; в цитозоль через мембрану железо не проникает. Электроны с Fe2+ акцептируются особым медьсодержащим белком — рустицианином, находящимся в периплазматическом пространстве.

Затем с рустицианина они передаются на цитохром c, локализованный на внешней стороне ЦПМ, а с него на цитохром a1, расположенный на внутренней стороне мембраны. Перенос электронов с цитохрома a1 на 1/2O2, сопровождающийся поглощением из цитоплазмы 2H+, приводит к восстановлению молекулярного кислорода до H2O. Особенность дыхательной цепи Т. ferrooxidans — отсутствие переноса через мембрану протонов, а перенос только электронов. Градиент H+ по обе стороны ЦПМ поддерживается как за счет поглощения протонов из цитоплазмы, так и в результате низкого pH внешней среды, в которой обитают эти бактерии. Синтез АТФ происходит за счет движения H+ из внешней среды в цитоплазму через АТФ-синтазный комплекс. Движущей силой служит в основном DpH. Для синтеза 1 молекулы АТФ необходимо окислить как минимум 2 молекулы Fe2+.

Образование восстановителя происходит в результате энергозависимого обратного переноса электронов. Активность участка дыхательной цепи, обеспечивающей обратный электронный транспорт, на порядок ниже активности короткого участка, функционирование которого приводит к получению энергии. В целом для фиксации 1 молекулы CO2 в восстановительном пентозофосфатном цикле необходимо окислить больше 22 молекул Fe2+. Таким образом, из всех представителей эубактерий, у которых обнаружена способность к окислению железа и/или марганца, только облигатно ацидофильные формы могут использовать энергию окисления Fe2+ для ассимиляции CO2, т. е. существовать хемолитоавтотрофно. Именно они являются истинными железобактериями, соответствуя тому названию, которое было введено С. Н. Виноградским.

Для остальных организмов образование окислов железа и марганца не связано с получением энергии и происходит в результате неспецифических реакций ионов металлов с продуктами метаболизма, прежде всего продуктами неполного восстановления O2. Неспецифичность функции перекисного окисления железа и марганца, проявляющейся у широкого круга эубактерий, ставит вопрос о правомерности использования термина "железобактерии" в значении, предложенном X. Молишем. Некоторые авторы в связи с этим считают целесообразным для обозначения остальных организмов использовать названия "железоокисляющие" и "марганецокисляющие" бактерии.

Эубактерии, описанные в этом разделе, широко распространены в природе и могут существовать в большом диапазоне условий. Облигатные ацидофилы обнаружены в подземных водах сульфидных месторождений, кислых водах железистых источников и кислых озерах с высоким содержанием закисного железа. Нитчатые формы также занимают вполне определенные экологические ниши. Представители рода Leptothrix — обитатели олиготрофных железистых поверхностных вод, Sphaerotilus предпочитают среды с высоким содержанием органических веществ.

Нитрифицирующие бактерии Получают энергию в результате окисления восстановленных соединений азота (аммиака; азотистой кислоты). Впервые чистые культуры этих бактерий получил С. Н. Виноградский в 1892 г., установивший их хемолитоавтотрофную природу. В IX издании Определителя бактерий Берги все нитрифицирующие бактерии выделены в семейство Nitrobacteraceae и разделены на две группы в зависимости от того, какую фазу процесса они осуществляют. Первую фазу — окисление солей аммония до солей азотистой кислоты (нитритов) — осуществляют аммонийокисляющие бактерии (роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus и др.):

NH4+ + 1,5O2 ® NO2 – + H2O + 2H+.

Вторую фазу — окисление нитритов до нитратов — осуществляют нитритокисляющие бактерии, относящиеся к родам Nitrobacter, Nitrococcus и др.:

NO2 – + 1/2O2 ® NO3 – .

Группа нитрифицирующих бактерий представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования.

Все нитрифицирующие бактерии — облигатные аэробы; некоторые виды — микроаэрофилы. Большинство — облигатные автотрофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в концентрациях, обычных для гетеротрофов. С использованием 14C-соединений показано, что облигатные хемолитоавтотрофы могут включать в состав клеток некоторые органические вещества, но в весьма ограниченной степени. Основным источником углерода остается CO2, ассимиляция которой осуществляется в восстановительном пентозофосфатном цикле. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии.