Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

Процесс нитрификации локализован на цитоплазматической и внутрицитоплазматических мембранах. Ему предшествует поглощение NH4+ и перенос его через ЦПМ с помощью медьсодержащей транслоказы. При окислении аммиака до нитрита атом азота теряет 6 электронов. Предполагается, что на первом этапе аммиак окисляется до гидроксиламина с помощью моно-оксигеназы, катализирующей присоединение к молекуле аммиака 1 атома O2; второй взаимодействует, вероятно, с НАД-H2, что приводит к образованию H2O:

NH3 + O2 + НАД-H2 ® NH2OH + H2O + НАД+.

Гидроксиламин далее ферментативно окисляется до нитрита:

NH2OH + O2 ® NO2 – + H2O + H+.

Электроны от NH2OH поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома c и далее на терминальную оксидазу. Их транспорт сопровождается переносом 2 протонов через мембрану, приводящим к созданию протонного градиента и синтезу АТФ. Гидроксиламин в этой реакции, вероятно, остается связанным с ферментом.

Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей 2 электронов. Окисление нитрита до нитрата, катализируемое молибденсодержащим ферментом нитритоксидазой, локализовано на внутренней стороне ЦПМ и происходит следующим образом:

NO2 – + H2O ® NO3 – + 2H+ + 2е–.

Электроны поступают на цитохром a1 и через цитохром c на терминальную оксидазу aa3 где акцептируются молекулярным кислородом (рис. 98, Б). При этом происходит перенос через мембрану 2H+. Поток электронов от NO2– на O2 происходит с участием очень короткого отрезка дыхательной цепи. Так как E0 пары NO2–/NO3– равен +420 мВ, восстановитель образуется в процессе энергозависимого обратного переноса электронов. Большая нагрузка на конечный участок дыхательной цепи объясняет высокое содержание цитохромов c и a у нитрифицирующих бактерий.

Многие хемоорганогетеротрофные бактерии, принадлежащие к родам Arthrobacter, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas и др., способны окислять аммиак, гидроксиламин и другие восстановленные соединения азота до нитритов или нитратов. Процесс нитрификации этих организмов, однако, не приводит к получению ими энергии. Изучение природы этого процесса, получившего название гетеротрофной нитрификации, показало, что, возможно, он связан с разрушением образуемой бактериальными культурами перекиси водорода с помощью пероксидазы. Образующийся при этом активный кислород окисляет NH3 до NO2–.

Нитрифицирующие бактерии обнаружены в водоемах разного типа и в почвах, где они, как правило, развиваются совместно с бактериями, жизнедеятельность которых приводит к образованию исходного субстрата нитрификации — аммиака.

Процесс нитрификации, являясь важным звеном в круговороте азота в природе, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Переведение азота из аммонийной формы в нитратную способствует обеднению почвы азотом, поскольку нитраты легко вымываются из почвы. В то же время нитраты — хорошо используемый растениями источник азота. Связанное с нитрификацией подкисление почвы улучшает растворимость и, следовательно, доступность некоторых жизненно необходимых элементов, в первую очередь фосфора и железа.

Водородные бактерии К водородным бактериям относят эубактерии, способные получать энергию путем окисления молекулярного водорода с участием O2, а все вещества клетки строить из углерода CO2. Таким образом, водородные бактерии — это хемолитоавтотрофы, растущие при окислении H2 в аэробных условиях:

H2 + 1/2O2 ® H2O.

Помимо окисления для получения энергии молекулярный водород используется в конструктивном метаболизме. H2 5 молекул H2, окисленного в процессе дыхания, приходится 1 молекула H2, затрачиваемого на образование биомассы:

6H2 + 2O2 + CO2 ® CH2O + 5H2O.

Молекулярный водород — наиболее распространенный неорганический субстрат, используемый эубактериями для получения энергии в процессе окисления. Число бактерий, растущих хемолитотрофно на основе использования H2 в качестве источника энергии, намного больше организмов, использующих для этой цели другие неорганические субстраты (восстановленные соединения серы, азота, железа).

Способность к энергетическому использованию H2 может сочетаться с конструктивным метаболизмом облигатно гетеротрофного типа (например, у представителей родов Azotobacter или Acetobacter) или происходить в строго анаэробных условиях (сульфатвосстанавливающие бактерии), что не позволяет относить обладающие этими особенностями организмы к водородным бактериям. Таким образом, водородные бактерии представляют только часть эубактерии, способных использовать H2 для получения энергии. Пути использования молекулярного водорода эубактериями суммированы в табл. 31. Водородные бактерии характеризуются способностью сочетать конструктивный метаболизм автотрофного типа (вариант 1) с получением энергии за счет окисления H2 с участием молекулярного кислорода (вариант 3).

Таблица 31. Пути использования молекулярного водорода эубактериями

Впервые водородные бактерии были описаны А. Ф. Лебедевым и Г. Казерером (Н. Kaserer) в 1906 г., а в 1909 г. С. Орла-Йенсен выделил их в самостоятельный род Hydrogenomonas.

Последующее изучение обнаружило сходство водородных бактерий с представителями разных родов гетеротрофных бактерий: Pseudomonas, Alcaligenes, Nocardia и др. Стало ясно, что водородные бактерии — не таксономическая группа, а организмы, объединяемые на основании нескольких физиологических признаков. Род Hydrogenomonas был ликвидирован, и виды, входившие в его состав, распределены по другим таксономическим группам.

К водородным бактериям относятся представители 20 родов, объединяющих грамположительные и грамотрицательные формы разной морфологии, подвижные и неподвижные, образующие споры и бесспоровые, размножающиеся делением и почкованием. Молярное содержание ГЦ-оснований ДНК водородных бактерий находится в диапазоне от 48 до 72%.

За исключением недавно описанных термофильных бактерий, выделенных в род Hydrogenobacter и характеризующихся облигатной хемолитоавтотрофией, все остальные водородные бактерии — факультативные формы, использующие в качестве источника углерода и энергии также разнообразные органические соединения, некоторые из них — и одноуглеродные соединения, более восстановленные, чем CO2 (окись углерода, метанол, формиат и др.). Ассимиляция CO2 происходит в восстановительном пентозофосфатном цикле. Водородные бактерии, растущие на органических соединениях, имеют тот же метаболический аппарат, что и хемоорганогетеротрофные эубактерии. Метаболизирование органических соединений у разных представителей этой группы осуществляется с помощью гликолитического, окислительного пентозофосфатного и Энтнера — Дудорова путей, а также ЦТК. и глиоксилатного шунта.

Электронтранспортная цепь водородных бактерий по составу аналогична митохондриальной (см. рис. 94). Большинство из них относится к облигатным аэробам. Однако среди облигатных аэробов преобладают виды, тяготеющие к низким концентрациям O2 в среде. Особенно чувствительны к O2 водородные бактерии, растущие хемолитоавтотрофно, а также в условиях фиксации молекулярного азота. Последнее объясняется инактивирующим действием молекулярного кислорода на гидрогеназу и нитрогеназу — ключевые ферменты метаболизма H2 и фиксации N2. Для некоторых водородных бактерий показана способность расти и в анаэробных условиях, используя в качестве конечного акцептора электронов вместо O2 нитраты, нитриты или окислы железа. Примером факультативно аэробных водородных бактерий может служить Paracoccus denitrificans, у которого в аэробных условиях работает электронтранспортная цепь, аналогичная митохондриальной, а в отсутствие O2 электроны с помощью соответствующих редуктаз переносятся на NO3 – и NO2 – , восстанавливая их до N2 (рис. 98, В). Однако большая часть факультативно аэробных водородных бактерий способна к восстановлению нитратов только до нитритов.

Как известно, способность к окислению H2 связана с наличием гидрогеназ, катализирующих реакцию: H2 ® 2H+ + 2e–. Гидрогеназы обнаружены у многих представителей прокариотного мира. В клетке гидрогеназы могут находиться в растворимом или связанном с мембранами состоянии. По этому признаку все изученные водородные бактерии могут быть разделены на 3 группы. Большинство содержит только одну форму фермента — связанную с мембранами. Есть виды, содержащие обе формы или только растворимую (цитоплазматическую) гидрогеназу.

Гидрогеназы, имеющие различную локализацию, вероятно, выполняют в клетке разные функции. Связанный с мембранами фермент не способен восстанавливать НАД+, передает электроны непосредственно в дыхательную цепь на уровне флаво-протеинов, хинонов или цитохрома b и, таким образом, имеет отношение только к энергетическим процессам. Растворимая гидрогеназа переносит электроны на молекулы НАД+, которые участвуют далее в различных биосинтетических реакциях.

Если водородные бактерии содержат обе формы гидрогеназы, функции между ними четко разделены. В случае отсутствия у водородных бактерий цитоплазматической гидрогеназы возникает проблема получения восстановителя при хемолитоавтотрофном способе их существования. Она решается с помощью механизма обратного переноса электронов на НАД+. При функционировании только цитоплазматической гидрогеназы она выполняет обе функции: часть восстановительных эквивалентов с НАД-H2 поступает в дыхательную цепь, другая расходуется по каналам конструктивного метаболизма. Таким образом, из всех хемолитоавтотрофных эубактерий только водородные бактерии с помощью определенной формы гидрогеназы могут осуществлять непосредственное восстановление НАД+ окислением неорганического субстрата. В электронтранспортную цепь электроны, следовательно, могут поступать с НАД-H2 или включаться на уровне переносчиков с более положительным окислительно-восстановительным потенциалом. С этим связан энергетический выход процесса: функционирование в дыхательной цепи 3 или 2 генераторов DmH+.

К образованию молекулярного водорода приводят разные процессы, в том числе и биологические. Активными продуцентами H2 являются эубактерий. Также активно осуществляется и потребление H2, важная роль в этом принадлежит водородным бактериям. Нахождение в природе и возможность размножения этих бактерий определяются рядом факторов; основные из них — наличие H2 и аэробные условия.

В последнее время водородные бактерии привлекают к себе внимание возможностью практического использования: для получения кормового белка, а также ряда органических соединений (кислоты, аминокислоты, витамины, ферменты и др.).

Карбоксидобактерии Карбоксидобактерии — аэробные эубактерий, способные расти, используя окись углерода (CO) в качестве единственного источника углерода и энергии. Таким свойством обладают некоторые представители родов Pseudomonas, Achromobacter, Comamonas67.

67 Способность окислять CO обнаружена у представителей прокариот, принадлежащих к эубактериям (пурпурные несерные бактерии, цианобактерии, клостридии) и архебактериям (метанобразующие бактерии). Однако в большинстве случаев этот процесс не поддерживает рост культур и механизм его неясен.

Карбоксидобактерии могут расти автотрофно, ассимилируя CO2 в восстановительном пентозофосфатном цикле, а также использовать в качестве единственного источника углерода и энергии различные органические соединения. При выращивании на среде с CO2 в качестве единственного источника углерода большинство Карбоксидобактерии энергию могут получать за счет окисления молекулярного водорода, при этом рост на среде с CO2 + H2 происходит активнее, чем на среде с CO. Это дало основание некоторым исследователям рассматривать Карбоксидобактерии как особую физиологическую подгруппу водородных бактерий. В то же время способность использовать в качестве субстрата дыхательный яд указывает на осуществление карбоксидобактериями нового типа хемолитотрофного метаболизма. Кроме того, обнаружение у них ферментов и факторов, отсутствующих у водородных бактерий, неспособность некоторых карбоксидобактерий окислять H2 и ряд других признаков позволяют сделать вывод об определенной обособленности этой группы эубактерий.

Использование CO карбоксидобактериями происходит путем его окисления в соответствии с уравнением:

CO + H2O ® CO2 + 2e – + 2H+.

Продукт реакции используется далее по каналам автотрофного метаболизма. (Таким образом, при выращивании карбоксидобактерий на среде с CO в качестве единственного источника углерода и энергии источником углерода служит не CO, а CO2). Теоретически суммарное уравнение окисления CO и синтеза клеточной биомассы карбоксидобактерий может быть представлено в следующем виде:

7СО + 2,5O2 + H2O ® 6CO2 + (CH2O), где (CH2O) — символ биомассы. Из уравнения видно, что окисление CO — неэффективный способ получения энергии. Карбоксидобактерий для синтеза клеточного вещества вынуждены окислять большое количество CO: на биосинтетические процессы в разных условиях роста идет от 2 до 16% углерода CO.

Окисление CO карбоксидобактериями осуществляется с участием по крайней мере одного специфического фермента — CO-оксидазы. Это флавопротеин, в молекуле которого содержится молибден и FeS-центры. Фермент в клетке находится в растворимой и связанной с мембраной форме. Растворимая CO-оксидаза локализована с внутренней стороны ЦПМ. При росте карбоксидобактерий на CO в качестве единственного источника углерода и энергии CO-оксидаза выполняет следующие функции: окисляет CO до CO2, передает электроны в дыхательную цепь и участвует в синтезе НАД-H2 путем обратного переноса электронов.

Состав дыхательных цепей карбоксидобактерий аналогичен таковому водородных бактерий. Для карбоксидобактерий Pseudomonas carboxydovorans показано, что дыхательная цепь разветвлена на уровне убихинона или цитохрома b. Одна ветвь (органотрофная) содержит цитохромы b558, c и a1, вторая (литотрофная) — цитохромы b561 и o. При окислении органического субстрата электроны поступают преимущественно в органотрофную ветвь цепи, при окислении H2 и CO — в обе. Низкая энергетическая эффективность использования CO карбоксидобактериями указывает на то, что перенос электронов по цепи в этом случае приводит к функционированию, вероятно, 1 генератора DmH+.

Одним из интересных свойств карбоксидобактерий является сам факт использования ими окиси углерода, служащей специфическим ингибитором терминальных оксидаз, таких как цитохромы типа a (см. рис. 94). Для некоторых карбоксидобактерий показана устойчивость к содержанию в атмосфере до 90% CO. В то же время в электронтранспортных цепях этих организмов не обнаружено необычных цитохромов. В качестве механизмов, приводящих к CO-устойчивости этих бактерий, обсуждаются: быстрая детоксикация CO с помощью окисляющего фермента; индукция ответвляющихся от основного пути CO-нечувствительных терминальных оксидаз, через которые и осуществляется перенос электронов на O2; повышенный синтез компонентов электронтранспортной цепи; пространственное разобщение процесса окисления CO и цитохромоксидаз, чувствительных к ней.

Основными источниками окиси углерода в природных условиях являются промышленное производство, транспорт, вулканическая деятельность и биологические процессы. Известно, что CO образуется в результате жизнедеятельности разных организмов (бактерии, грибы, водоросли, животные, растения). Одним из путей удаления этого токсического соединения служит использование его бактериями, и в первую очередь в наибольшей степени приспособленными для этого.

Эубактерий, восстанавливающие сульфаты

Все разобранные выше группы эубактерий, способных расти хемолитоавтотрофно, относятся к облигатным или факультативным аэробам. В отсутствие O2 факультативные аэробы получают энергию в процессе анаэробного дыхания, используя в качестве конечных акцепторов электронов некоторые окисленные соединения, например, нитраты, фумарат и др. Группа сульфатвосстанавливающих эубактерий, насчитывающая более 40 видов, приспособилась получать энергию окислением в анаэробных условиях H2, используя в качестве конечного акцептора электронов сульфат.

К сульфатвосстанавливающим эубактериям относятся организмы с различными морфологическими, физиологическими, биохимическими признаками. Среди них есть одноклеточные и нитчатые формы, неподвижные или передвигающиеся с помощью жгутиков, а трихомные — скольжением. Большинство имеют клеточную стенку грамотрицательного типа. Представители рода Desulfotomaculum характеризуются способностью образовывать эндоспоры. H2 гетерогенность группы указывает большой диапазон молярных значений ГЦ-оснований ДНК (37–67%).

Все сульфатвосстанавливающие бактерии — облигатные анаэробы. Многие из них относятся к категории строгих анаэробов, для роста которых требуется не только отсутствие O2, но и низкий окислительно-восстановительный потенциал среды. В то же время некоторые штаммы проявляют устойчивость к O2 и выживают при разной длительности аэрирования среды.

Число органических субстратов, используемых в качестве источника углерода и энергии в процессе восстановления сульфата, достаточно велико: сахара, спирты, органические кислоты (в том числе жирные кислоты, содержащие до 18 углеродных атомов), аминокислоты, некоторые ароматические соединения. Основным неорганическим источником энергии служит H2. Некоторые виды могут окислять CO в процессе сульфатредукции, осуществляя следующие реакции:

4CO + 4H2O ® 4CO2 + 4H2, DG0' = — 80 кДж/моль CO; 4H2 + SO42– + 2H+ ® H2S + 4H2O, DG0' = — 152 кДж/моль SO42–.

Для биосинтетических процессов при этом используются ацетат и CO2.

Предпринимаемые в течение длительного времени попытки показать способность сульфатвосстанавливающих эубактерий расти автотрофно в условиях окисления H2, сопряженного с восстановлением SO42 – , дали положительные результаты. Хемолитоавтотрофный рост обнаружен у представителей родов Desulfotomaculum, Desulfobacterium, Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfonema. У многих представителей группы выявлена способность в фиксации N2.

Ассимиляция CO2 у разных видов осуществляется по ацетил-КоА-пути (см. рис. 62) или восстановительному ЦТК (см. рис. 76).

В отношении метаболизирования органических соединений сульфатвосстанавливающие эубактерий делят на 2 группы. К .первой относят виды, окисляющие субстраты до ацетата и CO2. Вторую группу составляют организмы, полностью окисляющие органические вещества до CO2. В первом случае окисление субстратов завершается образованием ацетил-КоА, который дальше организмами не может окисляться и преобразуется в ацетилфосфат при участии фосфотрансферазы. Из ацетилфосфата в реакции, катализируемой ацетаткиназой, возникает ацетат. Превращение ацетилфосфата в ацетат сопровождается субстратным фосфорилированием.

При полном окислении органических соединений "судьба" ацетил-КоА разная: он может окисляться через "замкнутый" ЦТК или же по принципиально новому механизму. В этом случае происходит расщепление С-С-связи ацетил-КоА, приводящее в конечном итоге к образованию двух молекул CO2. В качестве промежуточных метаболитов идентифицированы связанные CO, метанол, формиат. Обнаружена высокая активность CO-дегидрогеназы. Все это напоминает ацетил-КоА-путь ассимиляции CO2, описанный у ацетогенных и ряда сульфатвосстанавливающих эубактерий, но функционирующий в обратном направлении (см. рис. 62).