Гуттман Б., Гриффите Э. и др. - Генетика

Успех эвфеники зависит от изменения окружающей среды. И тут на первый план выходит мнение, что большинство заболеваний вызывается внешними, а вовсе не наследственными факторами. Кроме того, степень проявления признаков, характерных для многих наследственных нарушений, связанных с одним геном (и для некоторых, связанных с многими генами), во многом зависит от внешних условий. Поэтому, как выразилась медицинский генетик Пат-рисия Бэйрд, не следует переоценивать генетический подход применительно к общественному здравоохранению. (Как мы увидим в гл. 12, такой подход будет приобретать все большую значимость по мере прогресса в геномике.) Пока наибольших достижений в области здравоохранения можно ожидать на уровне улучшения и контроля внешней среды.

Глава седьмая. Наследственный материал, днк

С самых первых научных исследований механизма наследственности ученых не переставал интересовать главный вопрос: «Что представляет собой наследственный материал?» В начале XX века гипотеза Саттона—Бовери о том, что гены находятся в хромосомах, стала общепризнанным мнением. Но какое химическое вещество в хромосомах служит переносчиком генетической информации? Еще на заре биохимии ученые предполагали, что на роль носителя информации подходят два основных вида химических веществ клетки — белки и нуклеиновые кислоты. И хотя об их строении было известно мало, белки, как более сложные, казались наиболее подходящим кандидатом. Поэтому считалось, что гены состоят из белков. Вместе с тем некоторые опыты свидетельствовали о том, что не стоит сбрасывать со счетов и нуклеиновые кислоты. Когда Э. Б. Уилсон публиковал свой классический труд «Клетка и ее роль в наследственности и эволюции», в одном издании он написал, что наиболее важный материал — белки, а в другом издании назвал нуклеиновые кислоты. Однако никто ничего не знал наверняка.

Ответ на этот ключевой вопрос дали исследования бактерий и поражающих их вирусов. В небольшой промежуток времени, в 1952—1953 годы стало окончательно ясно: наследственное вещество — это дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), и ее физическая структура определяет все основные феномены наследственности. Отождествление ДНК с генетическим материалом и открытие ее структуры — одно из величайших научных достижений XX века. Смысл этого открытия поистине грандиозен. Структура молекул ДНК в огромной степени определяет наши физические черты, включая строение нервной системы, поэтому можно предположить, что от ДНК во многом зависит наше поведение и даже наша личность. Знание структуры ДНК дает возможность проникнуть в тайны человеческой природы. История о том, как человек получил это знание и как были собраны воедино по кусочкам все детали сложной картины, служит замечательным примером изобретательности и гениальности человека.

Бактерии

Вспомним, что бактерии отличаются от других организмов тем, что они прокариоты, то есть не имеют окруженного мембраной ядра, в отличие от эукариот, в том числе растений и животных, в клетках которых имеется настоящее ядро. Кроме того, бактерии настолько малы, что разглядеть их можно лишь в очень хороший микроскоп (с увеличением 1000), и даже тогда их строение можно подробно рассмотреть лишь с помощью электронного микроскопа. На рис. 7.1 показаны относительные размеры некоторых наиболее распространенных бактерий и относительные размеры некоторых вирусов, которые еще меньше бактерий и которые также играют очень важную роль в изучении генетики.

Рис. 7.1. Большая бактерия Clostridium welchii имеет приблизительные размеры 4 х 1 мкм (микрометров). 1000 мкм = = 1 мм; 1000 нм (нанометров) = 1 мкм. Мелкие бактерии, такие как Escherichia coli и Serratia, могли бы вполне поместиться внутри нее вместе с другими, еще более мелкими бактериями и вирусами; TMV — вирус табачной мозаики Хотя мы обычно вспоминаем о бактериях исключительно в связи с болезнями, подавляющее их большинство — «добропорядочные» существа, обитающие в естественных водоемах, почве или в других организмах. Самая изученная бактерия Escherichia coli {E. coli)1 наряду с другими бактериями обитает в толстом кишечнике человека и входит в состав фекалий. (Эти бактерии помогают работе кишечника, а также обеспечивают нас некоторыми витаминами.) Бактерии часто изучают для того, чтобы научиться контролировать их патогенные (болезнетворные) виды, но они представляют интерес и с чисто научной точки зрения, потому что это относительно несложные одноклеточные организмы, быстро растущие в простой питательной среде. Организмы вроде Е. coli растут в растворе сахара, из которого они черпают энергию и получают атомы углерода, а также некоторых солей вроде сульфата магния и хлористого аммония, которые обеспечивают их другими строительными материалами. После стерилизации чашечки с такой питательной средой посредством нагревания в нее помещают бактерии.

Каждая клетка получает из внешней среды питательные вещества, материалы и превращает их в свои внутренние вещества при помощи большого количества ферментов. При этом она растет. (Следует заметить, что больше всего клетка производит ферментов, которые и помогают ей расти дальше.) После небольшого промежутка времени (около 30 минут) клетка делится пополам. Каждая из дочерних клеток в свою очередь продолжает расти и делиться: получаются четыре клетки, затем восемь, шестнадцать и т. д. Такая схема роста называется экспоненциальным ростом, и в чем-то она похожа на схему роста процентов капитала, при котором полученные за определенный период проценты включаются в общую сумму и учитываются при исчислении последующих процентов. (В случае с бактериями «процентные ставки» настолько велики, что достигают 100% за полчаса.) Несколько бактерий могут дать неисчислимое потомство, и их рост прекратится, когда в среде исчерпаются питательные вещества, кончится кислород или накопится слишком много отходов.

Питательная смесь агар (вещество, получаемое из водорослей и применяемое, в частности, как уплотнитель для мороженого) при остывании приобретает студенистую консистенцию, и на такой плотной основе легко выращивать и изучать бактерии. При помощи стерильной пипетки или проволочной петли на поверхность агара наносят бактерии и распределяют их стерильной стеклянной палочкой. Эта процедура называется посевом бактерий. Каждая клетка растет и размножается там, куда ее поместили, поэтому все дочерние клетки концентрируются в одном месте. Через некоторое время клеток становится так много, что появляются видимые колонии (рис. 7.2) определенного цвета и формы.

Рис. 7.2. Если раствор с бактериями нанести на поверхность питательной среды в чашке Петри, то каждая клетка вырастет в заметную для глаза колонию и образует клон бактерий По форме и цвету колоний можно опознавать разные бактерии и изучать их свойства. Каждая колония называется также клоном. Этот термин, который в современной молекулярной генетике приобрел специфические значения, обозначает прежде всего группу особей или клеток, произошедших от общего предка путем бесполого размножения. Земляника, например, может размножаться посредством отростков, которые пускают корни, и все получившиеся растения — это тоже клон. Отдельные клетки многих видов растений и животных можно выращивать также в чашках с питательной средой, где они в течение некоторого времени растут и делятся. Популяция клеток, полученных подобным способом от одной единственной клетки, также образует клон.

Первые шаги

В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил, что вещество умерших клеток одного штамма бактерий может переносить свои характеристики живым клеткам другого штамма. Например, было известно, что штамм IIIS бактерий Diplococcus pneumoniae может вызывать летальную пневмонию у мышей, тогда как штамм IIIR относительно безвреден. Гриффит нагрел раствор с клетками IIIS до высокой температуры, тем самым убив их, и перемешал остатки клеток с живыми клетками IIIR, после чего ввел мышам полученную смесь. Мыши погибли. По всей видимости, живые клетки вобрали в себя из мертвых клеток какой-то материал, который трансформировал их и передал им характеристики штамма IIIS. В 1944 году Освальд Т. Эйвери и его коллеги по Центру Рокфеллера в Нью-Йорке на опытах доказали, что трансформирующим фактором служит ДНК. Они разрушали белки и другие вещества клеток, но трансформация при этом продолжалась, но когда они разрушили ДНК, трансформация прекратилась.

Так был сделан первый важный шаг в исследовании генетического материала — его отождествили с нуклеиновой кислотой. Правда, подобные опыты ученую общественность особо не убеждали. Они расходились с данными, согласно которым молекула ДНК относительно проста по своей структуре. Многие биологи считали, что сложную генетическую информацию могут передавать только белки, имеющие сложную структуру, и это убеждение помешало им признать результаты опытов. Более убедительное подтверждение было получено в 1952 году в результате классического эксперимента иного рода.

Бактериофаги

В 1915 году англичанин Фредерик Творт и канадец Феликс Д'Эрелль независимо друг от друга открыли бактериофаги, которые вызывают инфекции среди бактерий. Сама идея об инфекциях среди бактерий может показаться на первый взгляд странной, поскольку мы уверены, что инфекции вызывают сами бактерии. Однако биологам хорошо известно, что у многих паразитирующих организмов имеются свои, более мелкие паразиты. Бактериофаги, или, как еще их называют, фаги, представляют собой вирусы, растущие внутри бактерий, подобно тому как другие вирусы размножаются внутри клеток растений или животных. На их примере можно исследовать общие особенности поведения вирусов.

Прежде всего, вирусы — это не организмы. Каждый организм состоит из одной или нескольких клеток, но полностью сформированные вирусные частицы, вирионы, гораздо меньше любой клетки.

Рис. 7.3. Общее строение вирусных частиц, или вирионов, вирусов бактерий и вирусов животных Они состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), заключенной в защитную белковую оболочку (рис. 7.3). Большинство вирионов имеют сферическую или вытянутую форму. Вирусы животных обычно попадают внутрь клеток, где присоединяются к поверхности клетки и поглощаются (подобно питательным веществам); вирусы растений обычно проникают через порезы, сделанные насекомыми или червями. Многие фаги, как тот, что показан на рис. 7.3, прикрепляются к бактериям при помощи «хвоста», или отростка. Это можно было увидеть еще на первых электронных микрофотографиях, сделанных до 1945 года. Тогда же выяснили, что фаги приблизительно наполовину состоят из белка и наполовину из ДНК. И хотя больше почти ничего о вирусах не знали, они оказались прекрасным материалом для генетических исследований.

Рис. 7.4. Фаги выращивают в чашках Петри, смешивая их образец с бактериями, в которых они могут размножаться, и с агаром. Эту смесь наливают поверх питательного агара в чашку. За несколько часов бактерии размножаются и равномерно распределяются по всему верхнему слою. Чистые участки, или бляшки, указывают на те места, где началась инфекция фагов, убивших бактерии С фагами удобно работать еще и потому, что они очень быстро размножаются, и за полчаса образуется 100—200 новых фагов. Их также легко выращивать в чашках Петри (рис. 7.4); немного фагов смешивают с теплым агаром и бактериями, и эту смесь наливают поверх слоя питательного агара. Бактерии растут тонким равномерным слоем, который называется газоном, а деятельность фагов приводит к образованию стерильных участков, или бляшек, в центре которых начиналась инфекция, погубившая клетки вокруг. Определить количество фагов в любом материале можно по количеству бляшек в образце. Кроме того, размер и форма бляшек обычно указывают на те или иные особенности фага. Исследования размножения фагов в начале 1940-х годов проводили Макс Дельбрюк, Сальвадор Лу-рия и Альфред Д. Херши, которых неформально называли американской фаговой группой. Их ученики и последователи изучили размножение фагов во всех подробностях, сконцентрировавшись на нескольких типах — от Т1 до Т7, паразитирующих на Е. coli. Открыть структуру и принципы функционирования генов удалось во многом благодаря именно этим исследователям.

Эксперимент херши—чейз

Зная, что фаги приблизительно наполовину состоят из ДНК и наполовину из белков, Альфред Херши и Марта Чейз решили исследовать функции этих двух компонентов, пометив их, то есть включив в их состав радиоактивные атомы, чтобы можно было следить за ними. Было известно, что белки содержат серу, но не имеют фосфора, в то время как в ДНК много фосфора, но нет серы. Поэтому одну часть фагов они вырастили на питательной смеси с радиоактивной серой (35S) и, следовательно, пометили радиоактивными атомами их белки, а другую часть — на питательной среде с радиоактивным фосфором (32Р), пометив их ДНК.

Электронные микрофотографии показывали, что по меньшей мере часть вирионов остается прикрепленной к поверхности инфицированных фагом клеток. Поэтому Херши и Чейз помещали инфицированные клетки в смеситель и сильно встряхивали их, чтобы «срезать» с них вирионы. Затем они помещали пробирки в центрифугу, после чего бактерии оседали на дно, измеряли радиоактивность осадка и надосадочной жидкости. Клетки, зараженные фагом 32Р, оказались очень радиоактивными, а клетки, зараженные фагом 35S, были радиоактивными в гораздо меньшей степени, причем основная часть радиоактивной серы оставалась в надосадочной жидкости. Этот эксперимент доказывал, что ДНК вируса внедряется в клетку, откуда ее невозможно выделить, тогда как оставшиеся на поверхности и состоящие из белка вирионы можно «стряхнуть» с клеток.

Затем Херши и Чейз доказали, что потомство фагов, образовавшееся в этих клетках, содержит большую часть радиоактивной ДНК, но почти или совсем не содержит радиоактивного белка. Поскольку развитие новых фагов определяет материал, внедряемый внутрь клетки, то следовал логичный вывод: ДНК и есть тот самый генетический материал. Возвращаясь к трансформации бактерий, можно утверждать, что живые клетки подбирают ДНК разрушенных клеток и замещают свои гены некоторыми генами из чужих ДНК.

Эксперимент Херши—Чейз подводил ученых к одному очень важному следствию. Фаги состоят исключительно из ДНК и белка. В клетку поступает только ДНК, которая и вызывает инфекцию. Через полчаса из клетки выходят новые фаги, состоящие из ДНК и белка. Следовательно, функция ДНК состоит в том, чтобы переносить информацию о постройке этих белков.

Многочисленные эксперименты с фагами помогли выявить схему их размножения, показанную на рис. 7.5. Когда фаг вроде Т2 или Т4 присоединяется к поверхности клетки при помощи отростка, его ДНК переходит в клетку-хозяина.

Рис. 7.5. Схема протекания фаговой инфекции: А — инфицирующий фаг внедряет свою ДНК в клетку, и эта ДНК начинает преображать клетку в фабрику по производству очередных фагов; ферменты, производимые фаговой ДНК, разрушают ДНК клетки-хозяина и останавливают действие ее генов; В — фаговая ДНК многократно реплицируется; происходит синтез новых фаговых капсидов; С — новые белки капсидов объединяются с ДНК и образуют новые фаговые частицы; D — новые фаговые частицы выходят после разрушения клетки Через несколько минут фаговая ДНК начинает синтезировать новые фаговые белки. Вначале создаются белки, отключающие функции клетки-хозяина; некоторые из них прекращают синтез белков хозяина, а другие являются ферментами, расщепляющими ДНК хозяина. Ряд других ферментов начинает репликацию ДНК фага. Вскоре синтез этих ферментов прекращается. Затем включаются новые гены, которые руководят строительством белков для капсида — белковой оболочки вируса. Эти белки самопроизвольно собираются в новые куски капсидов — головки, отростки и нити. Другие ферменты упаковывают вирусную ДНК в головку. Примерно через 30 минут после заражения клетку обычно заполняет две сотни новых вирионов, после чего происходит ее разрушение, или лизис, под действием других ферментов фага.

Строение днк

Вспомним, что основными строительными компонентами организма служат полимеры. Нуклеиновые кислоты — это тоже полимеры, хотя они сильно отличаются по своему строению от белков. Их еще называют полинуклеотидами, потому что они состоят из мономеров — нуклеотидов. Нуклеотид состоит из трех частей: основания, связанного с сахаром, который, в свою очередь, связан с фосфатом (РО4). Нуклеиновая кислота называется по сахару, который входит в ее состав; рибонуклеиновая кислота (РНК) содержит рибозу, а дезоксирибо-нуклеиновая кислота (ДНК) содержит дезоксири-бозу (в которой кислорода на один атом меньше). Основания представляют собой большие кольцевые молекулы с атомами азота; нуклеотиды ДНК имеют одно из четырех оснований: аденин, гуанин, ци-тозин и тимин (обозначаются A, G, С и Т; в РНК тимин заменяет урацил — U). Цитозин, тимин и урацил имеют по одному кольцу атомов и называются пиримидиновыми основаниями; аденин и гуанин имеют по два кольца и называются пуриновыми основаниями. Атомы углерода и азота в кольцах для удобства обозначают порядковыми номерами; атомы углерода сахара — от 1' до 5'.

Полинуклеотид (ДНК или РНК) образуется посредством связывания фосфата одного нуклеотида с сахаром другого именно так, что атом углерода 3' одного нуклеотида связывается через фосфатную группу с атомом углерода 5' следующего нуклеотида:

Поэтому каждая молекула ДНК имеет полярность 3'>5', подобно тому как белковая цепь имеет полярность от аминного конца до карбоксильного. Сами основания присоединены к одной стороне сахарофосфатного остова молекулы.

До 1952 года обычно предполагалось, что молекулы ДНК состоят из четырех видов нуклеотидов, чередующихся в регулярном порядке, поэтому казалось, что все молекулы более или менее одинаковы и не могут переносить информацию. Но когда Эрвин Чаргафф тщательно проанализировал состав ДНК различных организмов, обнаружилось, что нуклеотиды содержатся в них не в равной пропорции, а наблюдается следующее соотношение:

1. общее количество пуринов (А + G) почти точно соответствует общему количеству пиримидинов (С + Т); 

2. количество А почти равно количеству Т, а количество G — количеству С (А = Т, G = С); 

3. отношение (А + Т) : (G + С) сильно варьируется у разных организмов. 

В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик окончательно установили структуру ДНК. Уотсон был учеником Лурии, членом «фаговой группы» и прекрасно знал об экспериментах Херши—Чейз. Крик был физиком, разрабатывавшим мощный аналитический метод рентгеноструктурного анализа. С помощью рентгеновских лучей можно определить структуру молекул, даже если нельзя сфокусироваться на них, как фокусируются световые лучи в микроскопе. Посылаемые на материал рентгеновские лучи отклоняются на своем пути от атомов, и по изображению, оставленному ими на фотопленке, можно предполагать, как расположены атомы в кристалле. При помощи этой техники биофизики Морис Уилкинс и Розалинда Франклин из лондонского Королевского колледжа получили рентгенограммы, указывающие на то, что ДНК имеет спиралевидную структуру — нечто вроде штопора. Уотсон и Крик попытались построить модель ДНК при помощи атомных моделей нуклеотидов. Им это удалось, потому что они объединили данные Уил-кинса и Франклин с данными Чаргаффа и общей гипотезой о роли ДНК в наследственности. Уотсон рассказывает историю открытия в автобиографической книге «Двойная спираль». Чтобы получить более объективную информацию о ходе работ, эту книгу, пожалуй, лучше читать вместе с книгой Анны Сейр «Розалинда Франклин и ДНК».

Основная догадка Уотсона и Крика заключалась в том, что главная роль в структуре ДНК принадлежит основаниям, и надо как-то учитывать правило Чаргаффа: А = Т, G = С. Они предположили, что молекула ДНК состоит из двух полинуклеотид-ных цепей с противоположной полярностью, закрученных друг относительно друга по спирали (рис. 7.6). Между собой эти цепи удерживаются посредством оснований, соединенных попарно, при Рис. 7.6. Форма двойной спирали ДНК, по Уотсону и Крику чем аденин может соединяться только с тимином, а гуанин — только с цитозином: