Гуттман Б., Гриффите Э. и др. - Генетика

Теоретически нетрудно представить модель такого механизма. Регуляция по положению и развитие тела мухи Плодовая мушка оказалась в высшей степени полезной не только при изучении классических принципов наследственности, но и при исследованиях в области генетики развития. Будущую специализацию клеток определить легче всего по их местоположению. Глаза и рот должны развиваться на голове, конечности — в середине нижней (брюшной) части тела, крылья — на верхней части тела. Но как происходит изначальное деление на части тела? Если яйцеклетка однородна и практически симметрична, то, казалось бы, невозможно установить местонахождение будущих органов. Однако клетка развивается не отдельно сама по себе, а в окружении других клеток, которые и предоставляют ей пространственную информацию. Яйцеклетка дрозофилы развивается в яичнике мухи, в окружении 15 других клеток, называемых клетками-«нянями», от которых и зависят пространственные направления. Эти клетки связаны с развивающейся яйцеклеткой маленькими канальцами, через которые поступают вещества, необходимые для развития. Среди этих веществ могут быть специфические мРНК, которые начинают определять дифференциацию яйцеклетки (после того как она оплодотворена и стала зиготой). Принцип начальной дифференциации показан на рис. 11.3. Участвующие в этом процессе гены обозначены, как и обычно, по названиям мутаций, потому они имеют порой довольно забавные названия. Названия генов выделены курсивом; названия кодируемых ими белков начинаются с прописных букв и даны прямым шрифтом.

Рис. 11.3. Начальные взаимодействия генов, определяющих пространственную ориентацию эмбриона плодовой мушки. В передний конец внедряется мРНК bicoid и синтезируемый на ее основе белок Bicoid включает транскрипцию гена hunchback. Это приводит к транскрипции генов головы и груди. В задний конец внедряется мРНК nanos u синтезируемый ею белок. Nanos подавляет экспрессию белка Hunchback. Как следствие включаются гены брюшка Решающим событием служит внедрение мРНК bicoid в тот конец, который позже станет передним (и где будет расположена голова), а также внедрение мРНК nanos в тот конец, который позже станет задним. Белки, транслируемые с каждой из этих мРНК, либо способствуют синтезу хотя бы одного из белков, либо подавляют синтез. Затем цепь синтеза белков идет по нарастающей, пока белки не образуют разные структуры.

Как только начальное направление определено, включаются другие гены, которые делят эмбрион на сегменты, поскольку тело мухи членится на отдельные сегменты: 5 сегментов в области головы, 3 грудных сегмента и 11 в области брюшка. Задействованные при этом белки можно наблюдать при помощи подкрашивания их антител. Если развивающийся эмбрион погрузить в раствор антител, то антитела сконцентрируются там, где расположены соответствующие белки. Такие опыты показали, что сначала включается серия генов gap. Кодируемые ими белки активизируют серию генов pair-rule, которые делят эмбрион на 14 сегментов. Затем включаются гены segment-polarity, которые делят каждый сегмент на переднюю и заднюю части. После этого начинает действовать серия генов homeotic, которые определяют строение каждого сегмента с присущими ему признаками. Именно эти гены первыми были опознаны в мутантах необычной формы. Например, мутанты Antennapedia имеют на голове вместо усиков пару ног. Спаривая между собой различных го-меотических мутантов, Эд Льюис вместо обычных двукрылых вырастил четырехкрылых мушек.

Формирование глаза мухи

Одна из самых интересных серий событий с участием нескольких генов происходит при формировании глаза мушки дрозофилы. Сложный глаз насекомого состоит приблизительно из 800 элементов. Отдельный элемент, омматидий, состоит примерно из 20 клеток, расположенных в определенном порядке. Эти клетки образуют тонкий слой и взаимодействуют только со своими соседями; выше и ниже клеток нет. Обычно эти клетки становятся клетками хрусталика, но если они вступают в серию генетически запрограммированных взаимодействий друг с другом, то они специализируются в фоторецепторы, которые воспринимают свет и посылают в мозг сигналы. Дифференциация в каждом омматидии происходит в строго определенной последовательности (рис. 11.4). Сначала специализируется центральный фоторецептор, R8. Далее он вызывает специализацию своих соседей, R2 и R5. Потом они, в свою очередь, вызывают специализацию своих соседей с одной стороны, R3 и R4, и с другой стороны, R1 и R6. Под конец происходит специализация R7. Оставшиеся клетки группы становятся хрусталиком и другими структурами.

Дифференциация начинается после того, как через слой клеток из передней в заднюю часть проходит волна, видимая, как заметное углубление. После прохождения волны клетки начинают делиться и затем останавливаются на ранней стадии клеточного цикла. Ориентация волны, а следовательно, и группы фоторецепторов, зависит от экспрессии гена wingless (wg), продуктом которого является белок, сигнализирующий о начале выработки серии белков, выполняющих специфические действия по дифференциации. Клетки за волной начинают дифференцироваться и выделять белок Hedgehog (Hh). Hh растворяется в недифференцированных клетках и стимулирует их производить белок Decapentaplegic (Dpp). Dpp растворяется в еще большем количестве передних клеток, заставляя их дифференцироваться и выделять Hh, который в свою очередь запускает очередной цикл производства Dpp. Так циклическое производство белков Hh и Dpp заставляет волну двигаться вперед.

Рис. 11.4. Восемь клеток, которые становятся фоторецепторами в омматидии глаза дрозофилы, специализируются в определенном порядке, который зависит от взаимодействия нескольких генов и кодируемых ими белков Чтобы понять, как специализируются следующие клетки, рассмотрим клетку R7, хотя она и специализируется в последнюю очередь. Мутация sevenless (sev) происходит в гене, который требуется для дифференциации R7. Клетка R7 отличается тем, что это рецептор ультрафиолетового света, и мутанты sevenless могут быть опознаны по тому, что они не воспринимают ультрафиолетовый свет. Белок Sevenless служит рецептором на поверхности клетки, которая станет R7, и, как лиганд, он связывается с белком Boss, который кодируется геном bride-of-sevenless (boss) и вырабатывается клеткой R8. Таким образом, белок Boss клетки R8 дает инструкции соседней клетке по превращению в специализированную клетку R7.

Мы еще не знаем до конца, как именно запрограммированы все эти взаимодействия, но анализ некоторых мутантов вывил общую картину: одна из клеток вырабатывает определенные белки, которые взаимодействуют с белками соседних клеток, включая один набор генов и выключая другой. Если вернуться к вопросу, поставленному в начале главы, то придется ответить, что существуют разные механизмы развития. Одни гены кодируют белки, которые непосредственно связываются с другими генами, включая их или выключая. Другой класс генов кодирует белки, регулирующие трансляцию специфических мРНК в соответствующие им белки. Некоторые гены кодируют синтез белков, переходящих из одной клетки в другую и заставляющих их меняться или противодействующих переменам. Есть и такие гены, которые кодируют белки, взаимодействующие с другими белками на поверхности близлежащих клеток. Развитие эмбриона зависит от сложного переплетения разнообразных видов взаимодействий, среди которых мы упомянули лишь несколько самых распространенных.

Глава двенадцатая. Вмешателbство в строение днк: возвращение эпиметея?

В древнегреческих мифах говорилось о титанах — расе гигантов, рожденных богами прежде расы людей. Титану Эпиметею боги поручили создать животных и растения, распределив между ними разнообразные свойства. Но Эпиметеи (его имя переводится как «думающий после») взялся за дело слишком поспешно и исчерпал весь запас свойств, прежде чем дошел до людей. Поэтому он попросил своего брата Прометея похитить у богов огонь и подарить его людям. Этот поступок навлек гнев Зевса, пославшего Эпиметею прекрасную жену Пандору, которая должна была доставить ему немало страданий. Пандора открыла запретный ящик (также посланный на землю Зевсом), в котором хранились все бедствия и несчастья мира. Сегодня многие уверены в том, что генетики подобно современным Эпиметеям бездумно вмешиваются в тайны природы и могут нечаянно выпустить разнообразные бедствия из научного ящика Пандоры. Эти страхи еще более усилились, после того как генетики научились изменять строение ДНК. Теперь они стали подобны богам, получив возможность создавать организмы, которые никогда не существовали и не могли бы существовать без этой новой технологии.

Мы уже говорили, как, начиная с ранних эпох скотоводства и земледелия люди пытались выращивать новые сорта растений и разводить новые породы животных. Законы Менделя в XX веке помогли людям улучшить традиционные способы селекции, но все изменения до сих пор происходили только внутри отдельных видов. С появлением генных технологий в одном организме можно объединить признаки сразу нескольких других организмов, подобно тому как в древнегреческой мифологии созданное богами огнедышащее чудовище Химера изображалось с телом льва, головой козла и хвостом змеи. В данной главе мы поговорим именно об этом виде вмешательства в ДНК. Затрагиваемые при этом этические и социальные вопросы обсуждаются в следующей главе.

Рекомбинантная днк и рестриктазы

К 1972 году Анни Чанг, Поль Берг и Сеймур Коэн установили, что при помощи рестрикционных ферментов, рестриктаз, можно порезать две любые молекулы ДНК и сделать из них одну реком-бинантную ДНК. Именно это открытие легло в основу новой технологии, революционным образом преобразившей современную генетику и молекулярную биологию. Метод основан на стремлении комплементарных одинарных цепей нуклеиновых кислот соединиться между собой. Так, в растворе нуклеиновых кислот цепь с последовательностью GCTAT соединится с цепью CGATA. Особое внимание следует уделить тому, как рестриктазы режут ДНК. Вспомним, что большинство рестриктаз разрезают симметричные палиндромные фрагменты и часто оставляют короткие одинарные комплементарные концы цепей длиной в два—четыре основания. Например, фермент Sail режет ДНК следующим образом:

Все молекулы ДНК, порезанные этой рестрикта-зой, будут иметь одинарные фрагменты с одинаковой последовательностью. Эти концы могут соединяться посредством водородной связи, даже если они очень короткие. Поэтому если порезать две ДНК разных организмов одним ферментом и затем перемешать их, то можно получить много рекомбинантных молекул, составленных из ДНК обоих видов.

На практике эксперимент, как правило, сосредоточен на ДНК отдельного организма-донора, например мыши или человека. Эту ДНК изолируют и проводят над ней различные операции. Выделить ДНК из организма донора просто: достаточно разрушить клетки и при помощи этанола выделить осадок ДНК. Затем донорскую ДНК обрабатывают рестриктазой, чтобы она поделилась на мелкие фрагменты и эти мелкие фрагменты вставляют в маленькие реплицирующие молекулы ДНК, служащие вектором (лат. vector — несущий); векторные молекулы переносят интересующую ученых ДНК, с которой можно экспериментировать. Векторы могут реплицироваться, то есть увеличивать количество донорских фрагментов и предоставлять много копий для анализа. Наиболее часто использующиеся векторы — плазмиды, с которыми мы познакомились в гл. 10, то есть маленькие кольцевые ДНК, встречающиеся в бактериях и часто переносящие гены устойчивости к антибиотикам. Плазмиды не являются частью основного генома бактерий, поскольку встречаются штаммы, как с плазмидами, так и без них. Благодаря малому размеру и кольцевой структуре плаз-мидных ДНК их легко отделить от геномной ДНК бактерий. В качестве векторов также часто используют маленькие вирусные ДНК.

Порезав донорскую ДНК на фрагменты при помощи рестриктазы, той же рестриктазой режут векторную молекулу, имеющую один участок, соответствующий рестриктазе. Затем раствор двух ДНК смешивают и получают некоторое количество рекомбинантных молекул ДНК — это и есть векторы со встроенным донорским фрагментом:

Такие вставки нестабильны, но если добавить фермент ДНК-лигазу, то он соединит каркас молекул ДНК и сделает связь прочной. В полученном растворе имеется большое количество векторных молекул с различными донорскими вставками. Следующим шагом необходимо внедрить эти рекомбинантные молекулы в живые клетки, где они могли бы реплицироваться. Если в качестве векторов используют плазмиды, то раствор рекомбинантной ДНК просто добавляют в культуру бактерий без плазмид, обычно Е. coli. При надлежащей обработке клетки впитывают рекомбинантные векторы через стенки и мембраны. Обычно в одну клетку проникает только одна молекула. После посева в чашки клетки растут и делятся, увеличивая количество плазмид и вставок в них. Каждая из получившихся колоний бактерий является клоном ДНК, то есть популяцией идентичных бактериальных клеток, в которой размножается фрагмент донорской ДНК.

Ученые ведут учет этим колониям и сохраняют их. Вместе они образуют геномную библиотеку (банк). Если выведено и собрано достаточное количество колоний, то существует вероятность, что каждая отдельная часть донорского генома представлена в библиотеке хотя бы один раз. Так можно составить библиотеку геномной ДНК мыши, фрагменты которой представлены в виде вставок в плазмидные векторы внутри клеток бактерий.

Следующий шаг во многом зависит от цели эксперимента. С некоторыми возможностями мы познакомимся ниже.

Изучение отдельных клонированных фрагментов

Часто внимание экспериментаторов сосредотачивается на отдельном донорском гене, который ученые хотят исследовать или использовать. При определенной удаче такой ген может уже содержаться в геномной библиотеке, но как его опознать? Для определения гена, который в данном случае можно уподобить иголке в стоге сена, были разработаны различные хитроумные методы. Если библиотека составлена на основе геномной ДНК дикого типа, то можно добавлять ДНК из каждого клона в организмы, мутантные по интересующему нас гену. Затем можно исследовать эти клетки в поисках тех, что приобрели дикий фенотип. Данный метод, названный функциональной комплементацией, основан на том, что клетки большинства организмов внедряют в себя ДНК. ДНК может войти внутрь клетки пассивно либо при помощи электростимуляции. Если клетки-реципиенты достаточно велики, то ДНК можно ввести внутрь них. Существуют даже «генные пушки», которые выстреливают в клетку ДНК, связанную с металлическими частичками. В каждом случае введенная ДНК имеет все шансы внедриться в геном клетки-реципиента и начать функционировать в качестве обычного гена. Если клонированная ДНК, которую внедрили в клетку, имеет аллель дикого типа, а ген клетки — мутированный аллель, то клетка может превратиться в клетку дикого типа. Это свидетельствует о том, что данный клон ДНК переносит именно тот ген, который нужен.

Как только ген опознан, перед исследователями открываются многочисленные возможности. Одна из самых очевидных — секвенирование вставленного фрагмента ДНК и определение последовательности аминокислот кодируемого им белка. Сейчас в базах данных имеются сведения о строении огромного количества белков, и на их основании можно судить, какой тип белка кодирует данный ген. Если функция гена определена, то с его помощью можно выявить схожие гены в родственных организмах, поскольку существует эволюционная связь последовательностей ДНК между различными видами. Один из способов определения родственных генов — довольно эффективная технология, которую называют полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction, PCR), разработанная Кэри Маллисом в 1984 году. Она основана на том, что репликация ДНК начинается с праймера — короткого участка ДНК (или РНК), от которого продолжается синтез молекулы при помощи ДНК-поли-меразы. Последовательность клонированных генов можно использовать для составления коротких прай-меров на каждом конце интересующего сегмента. Эти праймеры указывают друг на друга на противоположных цепях ДНК и служат отправной точкой для полимераз, которые быстро передвигаются в противоположных направлениях и достраивают фрагменты между праймерами (рис. 12.1). Если удается получить достаточное количество фрагментов нужного размера, то их можно секвенировать и сравнить с последовательностью изначальной клонированной ДНК.

Метод PCR также применим при выявлении дефектных аллелей человека. Большинство рецессивных аллелей в популяции находятся в скрытом гетерозиготном виде, и болезнь проявляется только у гомозиготного потомства гетерозиготных организмов. Поэтому врачам так важно обнаружить гетерозигот. Если установлена последовательность специфического аллеля заболевания, то при помощи метода PCR его можно обнаружить, даже если его сопровождает аллель дикого типа.

Рис. 12.1. Для запуска полимеразной цепной реакции отрезок ДНК нагревают до разделения его на две цепи. Затем к участкам на двух цепях присоединяются прайме-ры, и цепи реплицируются при помощи ферментов, устойчивых к высоким температурам. Получившиеся молекулы вновь разделяют посредством нагревания, и цикл повторяется, в результате чего число молекул удваивается Некоторые доминантные дефектные аллели, например тот, что вызывает болезнь Геттингтона, иногда проявляются на довольно поздней стадии жизни. Метод PCR помогает обнаружить их заранее. Таким образом, клонирование и связанные с ним технологии, такие как PCR, постепенно внедряются в медицинский обиход.

Кроме того, клонированный ген можно использовать в качестве зонда для выявления гомологичных сегментов других нуклеиновых кислот посредством комплементарной конъюгации. ДНК клонированного гена метят либо радиоактивными атомами, такими, как 32Р, или флуоресцентным химическим веществом. Эту ДНК разделяют на две цепи и добавляют их к различным растворам одноцепочечных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Поскольку одноцепочечные нуклеиновые кислоты связываются с комплементарными одноцепочечны-ми нуклеиновыми кислотами, при помощи помеченных зондов можно обнаружить участки с заданной последовательностью.

Вообще зонды в генетике имеют разностороннее применение. Их можно использовать для определения местоположения гена на хромосоме или определения наличия и количества мРНК, транскрибированной с определенного гена.

Технология полимеразной цепной реакции и зонды используются также в судебной медицине для составления образцов ДНК, с помощью которых можно опознать преступника. Для образцов ДНК лучше всего подходят такие жидкости, как кровь или сперма. Но поскольку технология PCR весьма надежна, то надежные результаты могут дать и несколько клеток, прилипших, например, к волосам. ДНК разрезают рестриктазами, растворяют в геле и подвергают действию зонда. В результате получается набор фрагментов ДНК, часто упорядоченный в виде особой графической схемы, так называемый ДНК-отпечаток, или фингерпринтинг (рис. 12.2). Данный метод исходит из того, что, хотя у людей одинаковые гены находятся в одних и тех же позициях, между генами имеется множество некодиру-ющих участков с разными последовательностями, которые одним и тем же ферментом разрезаются по-разному. Для каждого некодирующего участка существуют свои зонды и PRC-праймеры, благодаря которым выяснено, что каждый человек имеет строго индивидуальное строение таких участков. Образец ДНК, полученный с места преступления, можно обработать вместе с образцами ДНК подозреваемых (а также жертв) и получить серию ДНК-отпечатков. Такой тест устанавливает как минимум невиновность одного обвиняемого и служит веским доказательством вины другого.

Рис. 12.2. Метод ДНК-отпечатков использован для установления невиновности одного из двух обвиняемых в изнасиловании. Образцы ДНК подозреваемых А и В протестированы вместе с ДНК жертвы (ряд 6), образцом ДНК семени с ее одежды (ряд 3) и образцом ДНК из влагалища (ряд 5). Полученные результаты говорят о невиновности подозреваемого А и указывают на то, что преступление мог совершить подозреваемый В При помощи метода клонирования генов можно создавать организмы с внедренными генами других организмов, и это, пожалуй, самое захватывающее достижение современной генетики, используемое в промышленных целях. Геном растения или животного можно изменять, добавляя особые клонированные молекулы ДНК, благодаря которым организм приобретает новые признаки.